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      肌苷注射劑雜質分析及處方工藝合理性探討

      嘉峪檢測網        2021-10-29 23:14

      摘要  目的:建立肌苷注射劑雜質分析方法,評價處方工藝合理性。方法:采用高效液相色譜法,色譜柱為Agilent TC C18-2(4.6mm×250mm, 5μm),以甲醇-水(5∶95)為流動相,流速1.0 mL·min-1,柱溫30 ℃;檢測波長248 nm(5-羥甲基糠醛檢測波長280 nm),進樣量10 μL;通過破壞實驗、原料及四種肌苷注射劑共計18批次樣品雜質的測定,分析肌苷原料和注射劑雜質的來源。結果:肌苷原料的工藝雜質為鳥苷、次黃嘌呤和腺苷,注射劑中主要降解雜質為次黃嘌呤,5-羥甲基糠醛為肌苷葡萄糖注射液中葡萄糖的降解產物;肌苷及各已知雜質之間分離度良好。結論:現行質量標準應增加已知雜質及其他單個雜質的控制,由于處方及工藝合理性存在問題,肌苷注射液與肌苷葡萄糖注射液兩種劑型安全性存在一定風險。

       

      關鍵詞:肌苷注射液;注射用肌苷;肌苷氯化鈉注射液;肌苷葡萄糖注射液;雜質;劑型合理性

       

      Impurity analysis of inosine injection and discussion on rationality of their formulations and processes

       

      KAN Weina, WANG Ji,YANG Hongwei

       

      (Liaoning Institute for Drug Control, Shenyang 110036,China)

       

      Abstract  Objective: To establish an impurity analysis method for inosine injections and evaluate the rationality of formulations and processes. Methods: HPLC separation was carried out in an Agilent TC C18-2 column (4.6 mm×250 mm,5μm) under the isocratic elution of methanol-water (5∶95). The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was 248nm(280nm for 5-hydroxymethyl furfural) and the injection volume was 10 μL. The sources of impurities of drug substance of Inosine and Inosine Injections were analyzed by the degradation test and the impurities determination of 18 batches of drug substance of inosine and four kinds of Inosine Injections. Results: Guanosine,hypoxanthine and adenosine were identified as the process impurities of Inosine. Hypoxanthine was the main degradation impurity in Inosine Injections,5-hydroxymethyl furfural was the degradation product of glucosein Inosine Glucose Injection. The resolutions between inosine and the known impurities peaks were good. Conclusion: The known impurities and other individual impurity should be controlled in the specifications. Due to the problems of rationality of formulations and processes,Inosine Injection and Inosine Glucose Injection have certain safety risks.

       

      Keywords:inosine injection; inosine for injection; inosine sodium chloride injection; inosine glucose injection; impurity; rationality of dosage form

       

      肌苷為細胞代謝改善類藥物[1],用于治療心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減小癥、視神經萎縮、中心視網膜炎,能預防及解除由血防藥物引起的對心臟或肝臟的副作用[2]。

       

      肌苷制劑分為口服制劑和注射劑[1],其中《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)收載的注射劑包括肌苷注射液、注射用肌苷、肌苷氯化鈉注射液和肌苷葡萄糖注射液不易口服給藥的患,注射劑具有藥效迅速,作用可靠等優勢,尤其適用于不易口服給藥的患者。但由于注射劑特殊的使用途徑,導致其毒副作用顯著,因此對于處方工藝、生產包裝以及產品質量都有更高的要求。

       

      本文參考文獻[1],調整流動相組成,使肌苷及已知雜質與相鄰峰得到良好分離,建立肌苷注射劑雜質的分析方法,并通過對四種注射劑雜質的分析,結合產品的處方及生產工藝,探討四種注射劑劑型及處方工藝的合理性。

       

      1 儀器與試藥

       

      1.1 儀器

       

      島津LC-20A高效液相色譜儀,Aglient 1200高效液相色譜儀;pH計,電子天平(MettlerToledo)。

       

      1.2 試劑試藥

       

      鳥苷對照品(批號:111977-201501),次黃嘌呤對照品(批號140661-200903),腺苷(批號110879-201703),5-羥甲基糠醛(批號111626-201912)均來自于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純,實驗用水為純化水。

       

      1.3 樣品信息

       

      肌苷原料(A廠家:批號17115134);肌苷注射液(規格2mL:0.1 g)(B廠家:批號180101273;C廠家:批號171003;D廠家:批號1801030;E廠家:批號1612061A;F廠家:批號18040129;G廠家:批號180516001B);注用肌苷(H廠家:規格0.2g,批號17120105;規格0.5 g,批號18030405;規格0.6 g,批號17060204;I廠家:規格0.2g,批號11804022;規格0.4 g,批號1180301;規格0.6 g,批號1180101);肌苷氯化鈉注射液(J廠家:規格100mL:肌苷0.6 g與氯化鈉0.9g,批號180528041;K廠家:規格250mL:肌苷0.5 g與氯化鈉2.25 g,批號K18012701;L廠家:規格100mL:肌苷0.5 g與氯化鈉0.9 g,批號1805132331;M廠家:規格100mL:肌苷0.6 g與氯化鈉0.9 g,批號3A18041005);肌苷葡萄糖注射液(N廠家:規格100mL:肌苷0.6 g與葡萄糖5.0 g,批號20180402,20180601)。

       

      2 方法與結果

       

      2.1 色譜條件

       

      色譜柱為Agilent TC C18-2(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為甲醇-水(5∶95);流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30 ℃;檢測波長為248 nm(5-羥甲基糠醛檢測波長為280 nm)。進樣量為10 μL。

       

      2.2 系統適用性試驗

       

      取次黃嘌呤、鳥苷對照品適量,精密稱定,分別加水制成每1 mL約含0.2 mg的溶液,作為對照品儲備液。取肌苷對照品適量,精密加入一定量的次黃嘌呤和鳥苷對照品儲備液,加水溶解并稀釋制成含肌苷0.5 mg·mL-1、次黃嘌呤1 μg·mL-1和鳥苷2.5 μg·mL-1的溶液。依法測定,色譜圖見圖1。肌苷峰與鳥苷峰的分離度應大于3.0,肌苷峰與相鄰雜質峰的分離度應大于1.5,理論板數按肌苷峰計不低于2 000。

       

      肌苷注射劑雜質分析及處方工藝合理性探討

      1.次黃嘌呤(hypoxanthine)  2. 肌苷(inosine)  3. 鳥苷(guanosine)

      圖1  肌苷有關物質測定系統適用性色譜圖

      Fig.1  HPLC chromatogram of system suitability for related substances of inosine

       

      2.3 溶液的配制

       

      2.3.1 對照品溶液

       

      取次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛對照品適量,精密稱定,加水溶解并稀釋制成每1 mL約含次黃嘌呤1μg·mL-1、鳥苷2.5μg·mL-1、腺苷1 μg·mL-1和5-羥甲基糠醛1μg·mL-1的溶液,作為混合對照品溶液,依法測定。

       

      2.3.2 供試品溶液

       

      精密量取樣品適量,加水稀釋制成含肌苷0.5 μg·mL-1的溶液,依法測定。

       

      2.4 專屬性試驗

       

      2.4.1 輔料干擾  試驗合肌苷氯化鈉注射液、肌苷注射液、注射用肌苷和肌苷葡萄糖注射液供樣企業提供的處方,按最大使用量配制,制成混合輔料溶液。典型色譜圖見圖2。結果顯示輔料對肌苷及次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的測定不存在干擾。

       

      肌苷注射劑雜質分析及處方工藝合理性探討

      圖2  混合輔料溶液高效液相色譜圖

      Fig.2  HPLC chromatogram of mixed excipients solution

       

      2.4.2 強制降解試驗

       

      熱破壞:稱取肌苷原料適量,置190 ℃,加熱30 min,加水溶解稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液,依法測定,記錄色譜圖。

       

      強酸破壞:稱取肌苷原料適量,加0.1 mol·L-1鹽酸2 mL,100℃水浴30 min,放冷,加0.1 mol·L-1氫氧化鈉2 mL,加水稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液,依法測定,記錄色譜圖。

       

      強堿破壞:稱取肌苷原料適量,加0.1 mol·L-1氫氧化鈉2 mL,100℃水浴30 min,放冷,加0.1 mol·L-1鹽酸2 mL,加水稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液,依法測定,記錄色譜圖。

       

      氧化破壞:稱取肌苷原料適量,加3%過氧化氫5mL,室溫放置30 min,加水稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液,依法測定,記錄色譜圖。

       

      光照破壞:稱取肌苷原料適量,置照度4600Lx光源下,光照24 h,加水溶解稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液,依法測定,記錄色譜圖。

       

      結果顯示(如圖3),在上述條件下破壞產生的降解產物均能與主峰分離,專屬性良好。熱破壞降解產物較多,主要為次黃嘌呤,還有其他未知雜質;強酸破壞主要降解產物為次黃嘌呤;強堿破壞產生多種未知雜質峰,但響應值較低;氧化及光照破壞無明顯降解產物產生。

       

      2.5 線性關系試驗

       

      取肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛對照品適量,精密稱定,分別加水制成每1mL約含0.2mg的溶液,作為對照品儲備液。分別精密量取一定量,加水稀釋制成含肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷、5-羥甲基糠醛系列濃度的混合對照溶液,作為線性溶液,依法測定,記錄色譜圖,以濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,記錄回歸方程及相關系數,結果見表1。

       

      2.6 定量限和檢出限

       

      取次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的對照品儲備液,分別精密量取一定量,加水稀釋制成含次黃嘌呤、鳥苷、腺苷5-羥甲基糠醛的混合對照溶液,并加水逐級稀釋,并依法測定。以S/N>10計,次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的定量限分別為0.015 6 μg·mL-1、0.054 1 μg·mL-1、0.069 6 μg·mL-1和0.064 1 μg·mL-1。以S/N>3計,次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的最低檢出限分別為0.003 9 μg·mL-1、0.013 5 μg·mL-1、0.017 4 μg·mL-1和0.016 0 μg·mL-1。

       

      2.7 有關物質的測定

       

      按“2.3”項方法制備溶液,依法測定,其中肌苷葡萄糖注射液同時在248 nm與280 nm的雙波長下測定。4種肌苷注射劑有關物質典型色譜圖見圖3。次黃嘌呤等4種已知雜質采用外標法,以相當于肌苷標示量的百分含量計,最大未知雜質含量及其他雜質之和采用面積歸一化法計。13個生產企業18批次4種肌苷注射劑有關物質測定結果見表2。

       

      肌苷注射劑雜質分析及處方工藝合理性探討

       

      A.堿破壞(alkalihy drolysis)  B.酸破壞(acid hydrolysis)  C.光破壞(photolysis)  D.熱破壞(heathy drolysis)  E.氧化破壞(oxidation)  F.原液(stock solution)  1.次黃嘌呤(hypoxanthine)  2.肌苷(inosine)  3.鳥苷(guanosine)  4.腺苷(adenosine)  5~8.未知雜質(unknown impurities)

      圖3  肌苷原料強制降解試驗色譜圖

      Fig.3  HPLC chromatograms of forced degradation solution of inosine

       

      肌苷注射劑雜質分析及處方工藝合理性探討

       

      3 討論

       

      肌苷是經枯草芽孢桿菌發酵得到的核苷類化合物。鳥苷與腺苷同為肌苷工藝雜質,亦是枯草桿菌發酵的產物,由于結構與肌苷較為相似,純化過程難以完全去除;次黃嘌呤是工藝雜質也是降解雜質,它既是枯草桿菌發酵過程中的代謝產物,也是肌苷主要的水解產物;5-羥甲基糠醛是含糖物質在加熱過程中產生的,對眼睛、上呼吸道、皮膚和黏膜等有刺激性,對人體橫紋肌及內臟有損害,具有神經毒性,能與人體蛋白質結合產生蓄積中毒[3-4],是肌苷葡萄糖注射液需要控制的雜質之一。

       

      4種肌苷注射劑中,肌苷注射液未知雜質的雜質數量最多及含量最高,肌苷葡萄糖注射液中,已知雜質次黃嘌呤含量最高,肌苷氯化鈉注射液中已知雜質鳥苷的含量最高,注射用肌苷中已知雜質和總雜的含量最低,雜質數量最少。

       

      鳥苷和腺苷為工藝雜質,其含量間接反映肌苷原料的質量,與制劑處方及工藝過程關聯較小。肌苷注射液中檢出的雜質除次黃嘌呤、鳥苷及腺苷外,其他未知雜質多達7個,其他雜質總量最高達1.0%,考慮是由于肌苷注射液本身肌苷含量較高(50 mg·mL-1),標準提高調研資料顯示,其制備工藝為肌苷加熱溶解于氫氧化鈉溶液中,由于肌苷溶液在加熱及強堿條件下不穩定,容易發生降解,未知雜質多為堿加熱降解的產物,這些未知雜質是否具有毒性還需要進一步的確認。5-羥甲基糠醛是葡萄糖單糖化合物在高溫或弱酸環境等條件下脫水產生的一種醛類化合物,當pH值偏低或受熱溫度過高,葡萄糖易轉變為5-羥甲基糠醛,若pH偏高,葡萄糖引起差向異構化,生成果糖,受熱生成5-羥甲基糠醛的速度更快,所以,葡萄糖為載體的注射劑pH值均控制在弱酸性[5]?!吨袊幍洹?015年版肌苷葡萄糖注射液要求控制pH值在4.0~6.0,而肌苷作為堿性藥物,溶液在偏堿性條件下相對穩定,因此,肌苷葡萄糖注射液中雜質次黃嘌呤的含量遠高于其他幾種注射劑。

       

      從表2結果可以看出,肌苷氯化鈉注射液,由于處方中肌苷含量較低,產品pH值控制在6.0~8.0,肌苷在該條件下相對穩定,雜質較少;注射用肌苷為以甘露醇為骨架的凍干塊狀物,降解雜質少,質量更加穩定。

       

      綜上,肌苷注射液由于工藝的因素,雜質數量與含量顯著高于其他幾種注射劑型,肌苷葡萄糖注射液由于處方的因素,導致雜質次黃嘌呤的含量顯著高于其他幾種注射劑型。肌苷注射液和肌苷葡萄糖注射液安全性存在較大風險?,F行質量標準中[1],只對肌苷注射劑中的總雜質的限度進行了規定,不足以控制各肌苷注射劑品種的質量,從注射劑的特殊性考慮,有必要對已知雜質及其他未知雜質從嚴控制。生產企業也應該從產品的原料、處方和工藝過程中,分析雜質的來源,優選原輔料,合理設計處方及工藝從而更好地控制產品的質量。

       

      參考文獻

       

      [1]  中華人民共和國藥典2015年版.二部[S]. 2015:378

      ChP 2015. Vol Ⅱ[S]. 2015:378

      [2]  王劍,劉永瓊,鄒瑩,等. 肌苷口服液雜質分析及肌苷溶液的穩定性研究[J]. 中國生化藥物雜志,2007,28(4):269

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      [5]  張文,馬巖,郭寧寧,等. 葡萄糖輸液中間品pH對成品中葡萄糖、PH穩定性及5-HMF量的影響[J]. 中國藥學雜志,1995,30(2):90

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      闞微娜,王棘,楊宏偉

      (遼寧省藥品檢驗檢測院,沈陽 110036)

       

       

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      來源:Internet

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