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      真實案例解析分析方法的驗證、轉移和確認

      嘉峪檢測網        2021-10-29 23:33

      摘要: 分析方法驗證、轉移和確認的目的是證明分析方法的適用性,對保證檢測結果的一致性、可靠性和準確性具有重要作用。方法驗證、轉移和確認的概念不同,適用范圍不同,在實際工作中存在一些模糊概念,而且也存在使用不當的情況。鑒于上述情況,本文詳細闡述藥品方法驗證、方法轉移、方法確認的聯系、區別、適用范圍,為藥品檢驗檢驗相關工作提供參考。

       

      分析方法驗證、轉移和確認的目的是證明所采用的分析方法適合于相應檢測要求和目的,被測樣品質量可控,保證得到一致、可靠和準確的測定結果,同時也證明檢驗人員有能力操作分析方法。方法學驗證、轉移和確認是建立和重現一個好的分析方法不可缺少的重要組成部分,通過方法學驗證、轉移和確認,可以對采用該方法所得到的檢測結果的質量和可靠性進行判斷。

       

      1、方法驗證、轉移和確認相關指導原則法規

       

      目前國內外和分析方法學有關的指導原則和技術文件中,大部分都是闡述分析方法驗證的內容,很少有專門闡述分析方法轉移和確認的文件。美國、歐盟、日本、澳大利亞、中國等國家和地區的藥品監管機構以及“人用藥品注冊技術要求國際協調會”( InternationalConference on Harmonization ofTechnical Requirements for Registration of Pharmaceuticalsfor Human Use, ICH) 、世界衛生組織( WorldHealthOrganization,WHO) 、國際標準化組織( InternationalOrganization forStandardization, ISO) 等國際組織都有專門的關于方法學驗證的指導原則。其中美國食品藥品監督管理局( U.S.Food and DrugAdministration,FDA) 在2000 年和2001 年分別發布了“化學藥品分析步驟和分析方法驗證指導原則”和“生物分析方法驗證指導原則”; 歐洲藥品監督管理局( European MedicinesAgency,EMEA) 于2004 年發布的GMP 指導原則對分析方法驗證有明確的要求,并于2011 年7 月21 日發布了“生物分析方法驗證指南( guideline onbioanalytical method validation) ”,2012年2 月1 日生效,用于藥代動力學和毒代動力學研究中生物樣品定量測定的分析方法驗證。

       

      ICH 在1995 年和1996 年分別發布了Q2A“分析步驟驗證-定義和術語”和Q2B“分析步驟驗證-方法學”; ISO 17025 于2005 年發布的“檢測和校準實驗室通用要求”第“5.4. 5”章節中對分析方法驗證提出了非常具體的規定和要求。另外,美國藥典( USP) 、歐洲藥典( EP) 、日本藥局方(  JP) 和中國藥典( ChP) 都有專門的附錄收載分析方法驗證指導原則。

       

      關于方法學確認, ISO 17025: 2005 通篇只在“5.4.2”中有一小段描述: “……在進行檢測或校準之前,實驗室應確認能夠正確操作這些標準方法。如果標準方法發生了變化,應重新進行確認”。最早發布相應技術文件專門闡述方法確認的是歐洲藥品質量控制實驗室聯盟( European Official MedicineControl Laboratories Network,OMCL) 。其在2005 年發布的質量保證技術文件“分析方法驗證”中指出。 ICH 分析方法驗證的指導原則主要是針對制藥企業而制定的,規定制藥企業在制定藥品分析方法時需要驗證哪些參數,用于向藥品監管機構證明該方法可行,產品質量可控。而歐洲各國的官方藥品質量控制實驗室從事的日常工作主要是根據藥典方法或者標準方法進行藥品檢測分析,藥典方法或標準方法都是經過驗證的方法,藥品檢驗實驗室在操作時,沒有必要再次對方法進行驗證。但是藥品檢驗實驗室需要證明藥典方法或標準方法對本次檢驗所測品種的適用性,即要進行方法確認。方法確認具體內容和方法的檢測類型有關,不同的檢測類型( 鑒別、雜質分析、含量測定等) 方法確認的內容不同。

       

      第1 次完整提出方法確認( method verification) 這個概念的是USP 32 版。USP 32 版附錄〈1226〉中收載了一個新的指導原則“藥典分析方法確認”( verification of compendial method) ,對方法確認的概念、方法確認的適用范圍進行了詳細闡述,至于方法確認的具體內容,USP 沒有詳細說明,只是給出了以下指導意見:1) 通過系統適用性試驗證明實驗室的操作能力和證明檢驗系統符合方法要求; 2) 判斷方法的復雜程度; 3) 確定方法操作的關鍵步驟和影響檢驗結果的關鍵方法學參數; 4) 根據方法的復雜程度,選擇最為關鍵的幾個方法學參數進行考察。

       

      2、藥品分析方法的分類

       

      藥品質量分析根據被測物的不同,分析方法通??煞譃榛瘜W藥品分析方法( analytical method) 和生物檢定方法( biological assay,or bioassay) 。

       

      化學藥品分析方法是指采用分析儀器或者裝置,對化學藥品( 包括中藥) 中的成分進行定性或者定量檢測分析。由于化學藥品成分相對單一和結構相對簡單,因此,相對應供試品溶液的制備方法和檢驗檢測也比較簡單,易于操作,能夠影響檢驗結果的因素比較少,對于同一份樣品來說,比較容易獲得一致的檢驗結果。

       

      生物制品( 包括疫苗、抗體、細胞因子、酶等) 的分析方法通常叫做“生物檢定方法”。根據ICH 的定義,生物檢定的內容包括: 測定某個特定器官對某個生物制品的生物學反應、測定細胞水平的生化或者生理學反應、免疫學作用下的酶反應速率或者生物學反應以及配體或者受體結合反應。由于生物制品的復雜性,生物檢定方法的范圍很廣,包括理化分析方法、效價測定方法、細胞活性測定、酶活性測定、免疫測定等,隨著新技術和新生物制品的不斷出現,生物檢定的范圍仍在繼續不斷擴大。由于方法的多樣性,長期以來國際上很難形成一個統一的生物檢定方法驗證指導原則。在日常檢驗工作和生物檢定方法建立的過程中,也缺乏相應的參考標準和指導文件。2013 年5 月1 日開始正式執行的USP36 版,在其附錄〈1032〉“生物檢定方法設計和建立( design and developmentof biological assay ) ”、〈1033〉“生物檢定方法驗證( biological assayvalidation)”和〈1034〉“生物檢定數據的分析( analysis ofbiologicalassay) ”中,對生物檢定方法的建立和驗證進行了比較全面的闡述,這是目前國際上最新,也是內容最為全面的關于生物檢定方法驗證的指導原則和參考文件,非常具有借鑒意義。

       

      除以上提到的化學分析方法和生物檢定方法外,有人把專門對生物基質( 如血液、血清、血漿或尿液) 中的藥物或者代謝產物進行定量測定的分析方法叫做生物分析方法( bioanalytical method)。其結果用于評價藥物的臨床前和臨床試驗效果,包括生物等效性、生物利用度、藥代動力學和毒代動力學等,這對于藥品研發來說至關重要,在藥品注冊時,這些研究材料都要提交給藥品監管當局進行審評。

       

      單從分析方法手段和操作過程來說,生物分析方法和化學藥品分析方法屬于同一范疇,都是采用分析儀器( 液相色譜、氣相色譜、質譜等) 和手段對被測物進行定性和定量分析。但由于樣品的特殊性,相對于化學藥品分析方法來說,生物分析方法更加復雜和困難。這是因為生物樣品中含有很多復雜的生物基質,這些生物基質對被分析物的準確測定干擾很大,即所謂的基質效應。如何盡可能地消除基質效應,進行合適的樣品前處理,是保證生物分析方法準確有效的關鍵因素。另外生物樣品的量一般都非常少,給樣品分析和方法驗證帶了很多不便; 再者,由于生物分析方法的結果用于計算藥代動力學結果,進而評價藥物在體內的行為,因此對生物分析結果的準確性和可靠性要求非常高。正是基于以上特點,相對于化學藥品分析方法,生物分析方法的驗證、轉移和確認更加復雜和煩瑣。但由于采用的分析手段和試驗操作基本上一致,因此兩者方法驗證、轉移和確認的基本原則和驗證項目總體上是一致的。

       

      3、方法驗證、方法轉移和方法確認概念

       

      解析各國藥品監管機構發布的指導原則以及ISO 17025 的規范性文件中關于方法學驗證的內容中,一般都會提到以下3 個概念: 方法驗證( methodvalidation) 、方法轉移( method transfer) 和方法確認( method verification) ,三者既相互聯系又有區別,都是為了保證檢驗方法適合于檢驗、被檢樣品質量可控,同時確保檢驗人員有能力操作方法; 但由于檢驗目的、檢驗人員、檢驗環境等因素的不同,以上3 個概念的內涵和側重點又有所不同。由于國內關于方法學驗證、轉移和確認的內容大部分都是由英文版本翻譯而來,不同檢測領域的譯者和專家在翻譯過程中理解程度和術語用詞都不盡相同,另外,除方法學驗證外,目前國內外很少有專門闡述方法轉移和方法確認的公開指導原則和技術文件。以上原因導致國內藥檢系統實驗室質量管理人員和檢驗人員對方法驗證、轉移和確認的概念不清,理解混亂,尤其是方法確認,各地藥檢人員在實際工作中缺乏明確統一的指導,具體做法不盡一致,造成了很多不必要的重復勞動,且浪費資源。本文結合國際上有關的指導原則對這3 個概念進行解析。

       

      3.1 方法驗證

       

      WHO、FDA、USP 和ISO 17025 對于分析方法驗證的定義和解釋基本一致,其核心是實驗室通過試驗設計和測試,證明被驗證的方法適用于該方法擬定的檢測用途。從這個定義可以看出,方法驗證主要由方法建立者進行,方法建立者必__須要證明所建立的方法能夠滿足期望的檢測用途。由于大部分藥品質量控制方法是由生產企業建立,因此方法學驗證的工作大部分是由企業的分析方法研發部門來進行。制藥企業在研發產品的過程中,隨著產品研發過程的不斷深入,產品的質量控制方法也在根據產品的變化而不斷調整和優化,最終形成一個終產品質量控制方法。企業的研發部門在建立質量控制方法時,需要對該方法進行充分的驗證,以證明所建立的質量控制方法能夠達到控制本產品質量的目的。在方法驗證的過程中,為了證明方法可行,就要對方法學涉及的相關參數進行驗證,具體驗證哪些參數和方法的用途有關。

       

      許多國家和地區的藥品監管機構以及國際組織都有各自的分析方法驗證指導原則,這些指導原則中要求的驗證參數也不盡相同,而且不同指導原則對有些參數的定義也存在差異,為了能夠有一個統一的術語和定義,來自歐盟、美國和日本藥品監管機構和制藥工業的專家組成ICH 工作小組制定了方法學驗證參數定義、驗證要求,形成了ICH 相關指導原則,該原則是目前方法學驗證最具代表性的一個指導原則。表1 中列出了ChP、USP、EP 和ISO17025 中定義和要求的方法學驗證參數。

       

      真實案例解析分析方法的驗證、轉移和確認

       

      同時,由于方法的檢測目的不同,各方指導原則對于不同檢測目的的方法所要求的驗證的參數也有所不同,表2 中列出了ICH 指導原則中規定的不同檢驗目的需要驗證的參數。

       

      真實案例解析分析方法的驗證、轉移和確認

       

      3. 2 方法轉移

       

      一個實驗室建立了分析方法并經過驗證后,當其他實驗室( 方法接收實驗室) 在使用這個方法進行檢驗檢測時,就牽涉到方法在2 個不同實驗室之間的轉移問題,接收方法的實驗室需要證明其能夠成功地在本實驗室中運行該方法,這就是所謂的方法轉移。常見的方法轉移情況有: 分析方法由公司的研發實驗室轉移到質控實驗室; 由于生產線轉移使分析方法從A 生產地點轉移到B 生產地點; 分析方法由某公司轉移到合同公司; 由于X公司購買了Y 公司的產品,方法由Y 公司轉移到X公司。目前,很多大型跨國制藥企業都建立了其內部的方法學轉移指導文件和規程,但沒有一個官方指導原則來具體說明接收方法的實驗室如何具體操作。唯一比較有名的一個指導性文件是2009 年美國藥典附錄專家委員會在美國藥典論壇上發表了一篇題為“分析方法轉移-新附錄的建議”的論述性文章。

       

      方法轉移這個概念包含3 個要素,即方法建立實驗室、方法接收實驗室和比對性測試。所謂的轉移,就必須至少包括2 個實驗室,即方法建立實驗室和方法接收實驗室。方法建立實驗室負責分析方法的建立和驗證,當其他實驗室需要按照已經建立好的方法進行檢驗檢測時,這些實驗室統稱為方法接收實驗室。方法接收實驗室需要證明其能夠成功地在本實驗室操作該方法,最常用的方式就是比對性測試,如果接收實驗室采用該方法對樣品測定的結果與方法建立實驗室測定的結果兩者之間比對的結果符合轉移之前確定的相關接受標準,就說明方法接收實驗室能夠和方法建立實驗室一樣有能力成功地操作此方法,方法轉移成功。被測樣品的數量與方法的重要性、復雜性和接受實驗室此前是否有操作此類方法的經驗有關。在方法轉移之前,要注意確保方法接收實驗室的工作人員對方法中涉及的關鍵參數有詳細的了解。另外很重要的是建立一份詳細的轉移步驟程序,確保雙方實驗室有關人員之間有良好的溝通。轉移程序要說明檢測內容和雙方實驗室的職責,同時要確定各參數的轉移可接收范圍。

       

      比對性測試中考慮的因素包括: 被測樣品的數量、批次( 比如2~ 5批) ,被測樣品的濃度級別( 比如1~3個濃度) ,重復測定次數( 比如4~6次) ,被分析物個數( 比如1~2 個) ,分析時間( 比如2~ 5d) ,來自1 個或多個企業的分析儀器( 2個實驗室都用相同的儀器) 。

       

      對于我國藥品檢驗所來說,涉及方法轉移的一項日常工作就是進口藥品質量標準復核。根據我國《藥品注冊管理辦法》規定,當國外藥品申請在中國注冊上市時,需要報送3 批樣品在中國食品藥品檢定研究院或各口岸藥品檢驗所進行進口藥品質量標準復核,同時提交相應的分析方法、方法學驗證資料以及3 批樣品的出廠檢驗結果。復核過程通常是在對3 批樣品進行分析檢驗的基礎上判斷企業的分析方法是否可行,產品質量是否可控,提出具體復核意見,最終制定出藥品進口注冊質量標準。對于有些處方成分較多、分析方法復雜的品種,在制定進口注冊質量標準中的某些檢驗項目時( 比如含量測定或有關物質測定) ,會按照企業質量標準起草進口注冊標準中的檢驗方法,不做改動。這種情況就是方法轉移過程,涵蓋了方法轉移的3 個要素。方法建立實驗室是生產企業的研發實驗室或質控實驗室,方法接收實驗室是進口藥品質量標準復核實驗室。在復核過程中有一個很重要的步驟就是復核實驗室將3 批樣品測定的結果與企業的測定結果進行比對,一方面證明方法在不同實驗室對產品質量的可控性,另一方面證明方法的可行性( 即復核實驗室能夠成功地操作企業建立的分析方法) 。

       

      3. 3 方法確認

       

      在日常檢驗工作中,經常將方法確認和方法轉移以及方法驗證這3 個概念相混淆,尤其是方法確認,大家的理解參差不齊,做法各異。方法確認的核心有三點,第一: 方法確認必須是對藥典分析方法或者法定分析方法進行確認; 第二: 證明藥典分析方法或法定分析方法適用于被測樣品,被測樣品的質量可控,方法可行; 第三: 證明方法使用人員有能力成功地操作藥典分析方法或者法定分析方法。

       

      關于方法確認,目前,WHO、ISO 17025、美國FDA 以及USP 發布的指導原則對于上述第一點是非常一致的,只要說到方法確認,一定是對藥典分析方法或者法定分析方法進行確認。對于第二點和第三點來說,WHO 和美國USP、FDA 的定義在側重點方面各有不同。WHO 在藥品質量控制實驗室操作規范( good practice for quality control laboratories,GPCL) 中明確指出: 方法確認是證明一個藥典分析方法或者經過驗證的法定分析方法適用于本次檢驗的過程。WHO 的定義側重于強調第二點,即證明藥典分析方法對產品的適用性。ISO 17025和美國FDA、USP 對方法確認的定義基本上可以總結為: 檢驗實驗室和方法使用者應該證明其對藥典方法有充分的了解并且有能力重現藥典方法??梢?,ISO 17025 和美國FDA、USP 對方法確認的定義側重于第三點,即強調檢測實驗室和檢驗人員操作藥典方法的能力。如果將WHO 和美國USP、FDA 的定義結合起來,就是一個相對完整的方法學確認的定義,即: 方法確認的目的是證明藥典分析方法或法定分析方法適用于被測樣品,被測樣品的質量可控,方法可行,同時還證明方法使用人員有能力成功地操作藥典分析方法或者法定分析方法。

       

      通過以上概念的解析可以看出,藥品檢驗實驗室在采用藥典分析方法或者法定分析方法進行檢驗時,不需要再對方法進行驗證,但是需要進行方法確認,以證明承檢實驗室能夠正確地操作藥典方法。具體確認需要進行哪些內容,則沒有明確的規定,僅根據方法本身的特點和檢驗人員對方法操作的熟練程度由檢驗實驗室自己確定。USP 在其附錄〈1226〉“藥典分析方法確認( verification ofcompendialmethods) ”中對藥典分析方法確認需要確認哪些內容給出了以下指導意見: 1) 通過系統適用性試驗證明實驗室的操作能力和證明系統符合方法要求; 2) 判斷方法的復雜程度; 3) 確定方法操作的關鍵步驟和影響檢驗結果的關鍵方法學參數; 4) 根據方法的復雜程度,選擇最為關鍵的幾個方法學參數進行驗證。

       

      從USP 的闡述可以看出,系統適用性試驗是一個重要的方法學確認內容,通過系統適用性試驗來證明實驗室的操作能力和證明系統符合方法要求,但是方法確認僅僅做系統適用性試驗還不夠,完整的方法確認相當于對方法的適用性進行考察,就是實驗人員根據對方法的理解,除了系統適用性試驗外,還要選擇幾個認為對該方法來說最為關鍵的方法學參數進行考察。方法驗證、方法轉移和方法確認的聯系與區別見表3。

       

      真實案例解析分析方法的驗證、轉移和確認

       

      4、方法學驗證、轉移和確認具體實例

       

      2003 年日本藤澤公司申請注冊進口他克莫司軟膏劑( 2種規格: 30g:0.03%支-1 和30g:0.1%支-1) ,用于治療過敏性皮炎。筆者所在實驗室承擔了進口注冊質量標準復核工作。按照要求,藤澤公司報送2 個規格各3 批樣品、空白軟膏基質、含量測定和有關物質測定所需標準物質,并提交了質量標準、方法學驗證資料及3 批樣品的出廠檢驗結果。

       

      下面以他克莫司軟膏劑的含量測定為例來說明方法驗證、方法轉移和方法確認的整個過程。

       

      4.1 方法驗證

       

      本品采用HPLC 法進行含量測定。鑒于軟膏樣品的特殊性和本品含量測定方法的復雜性,復核實驗室決定在重現企業分析方法的基礎之上按照企業質量標準起草進口注冊質量標準。由于含量測定方法由企業建立,因此企業在提供質量標準的同時也提供了完整的HPLC 法含量測定的方法學驗證資料和數據。復核實驗室對企業的方法學驗證資料和數據進行了審核,認為企業的含量測定方法學驗證結果表明該法對產品的質量可控。

       

      4. 2 方法轉移

       

      鑒于該品種處方和含量測定方法的復雜性,復核實驗室決定起草的進口注冊質量標準中含量測定方法按照企業方法制定,不做改動。復核實驗室根據企業提供的含量測定方法,對企業提供的2 個規格6 批樣品進行了檢驗,并將檢驗結果與企業提供的出廠檢驗結果進行了比對,見表4。

       

      真實案例解析分析方法的驗證、轉移和確認

       

      這個過程就是一個完整的方法轉移過程,方法建立實驗室是日本藤澤公司研發實驗室,方法接收實驗室是復核實驗室,檢驗結果的比對結果表明,2個規格共6 批樣品,復核實驗室的檢驗結果與企業出廠檢驗結果之間的誤差均在1. 5% 之內,滿足了預先設定的該品種含量測定方法差異的限度( 誤差不得過2%) ,說明復核實驗室有能力正確操作方法建立實驗室建立的含量測定方法,方法轉移成功。在此基礎上,復核實驗室根據企業質量標準起草了他克莫司軟膏劑含量測定進口復核質量標準,并上報國家食品藥品監督管理局批準。

       

      4.3 方法確認

       

      該品種注冊申請成功后,由某口岸進口,口岸藥品檢驗所所根據國家食品藥品監督管理局批準的進口藥品注冊質量標準進行通關檢驗。在檢驗過程中,鑒于含量測定方法的復雜性,該口岸藥品檢驗所經常就檢驗細節和注意事項與方法起草單位( 復核單位) 進行溝通交流,雙方一致認為: 由于含量測定供試品溶液制備過程中涉及到較為復雜的軟膏前處理過程( 軟膏稱量、有機溶劑提取、水浴、冰浴和離心等步驟) ,對檢驗結果影響最大的一個關鍵方法學參數是精密度( 包括中間精密度) ,因此,口岸藥品檢驗所在根據進口注冊檢驗標準對他克莫司軟膏劑進行通關檢驗時,除了系統適用性之外,還要對方法的精密度進行考察,以充分保證口岸藥品檢驗所能夠正確地按照進口注冊檢驗標準進行通關檢驗。以上過程就是一個典型的方法確認過程,首先口岸藥品檢驗所根據國家食品藥品監督管理局批準的進口注冊檢驗標準進行檢驗,也就是說檢驗標準是法定標準,進口檢驗時需要進行方法確認。根據方法的特點,確定關鍵的方法學參數并對其進行考察,以保證方法的正確操作。

       

      5.結語

       

      藥品分析方法驗證、轉移和確認的目的是證明所采用的分析方法適合于相應檢測要求和目的,被測樣品質量可控,保證得到一致的、可靠的和準確的測定結果,同時也證明檢驗人員有能力成功地操作分析方法。一個好的分析方法,對于獲得準確可靠的檢驗結果至關重要。目前國內外關于分析方法驗證的指導原則和技術文件很多,但是關于方法轉移和確認的內容很少; 同時,由于國內很多技術文件都是由英文翻譯過來,而譯者的工作背景、語言用詞以及在理解程度上的不同,也造成國內對方法驗證、轉移和確認概念不清,理解不到位; 另一方面,現有的文件和指導原則大都是闡述原則性和定義的內容,很少有具體實例,廣大藥檢工作者在實際工作中形成了“指導原則每個字都認識,但是實際工作還是不知道如何做”的局面。希望通過本文的介紹,能幫助國內藥品質量控制人員理清概念,在實際工作中做到理論結合實際,并加以具體應用。

       

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      來源:《藥物分析雜志》

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